Оптимизация условий очистки и рефолдинга рекомбинантного эфрина-А5 из телец включения Escherichia coli

  • Александр Вячеславович Жидецкий Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь
  • Михаил Васильевич Шолух Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь
  • Юрген Райнер Ханнеман Биберахский университет прикладных наук, ул. Карлштрассе, 11, 888400, г. Биберах, Германия
  • Рене Хандрик Биберахский университет прикладных наук, ул. Карлштрассе, 11, 888400, г. Биберах, Германия
  • Жанна Витальевна Мотылевич Гродненский государственный медицинский университет, ул. Горького, 80, 230009, г. Гродно, Беларусь
  • Юха-Пекка Химанен Институт исследования рака Sloan Kettering, 1275 Йорк авеню, 10065, г. Нью-Йорк, США

Аннотация

В результате настоящего исследования разработана методика выделения, очистки и рефолдинга рекомбинантного эфрина-А5 из телец включения Escherichia coli. В основу легли спектрофотометрические, электрофоретические, хроматографические методы, а также рефолдинг методом разведения и на матрице аффинного сорбента. Благодаря оптимизации условий отмывки и солюбилизации телец включения установлены составы отмывочных и солюбилизирующего растворов, позволяющие наиболее полно избавиться от примесных соединений с наименьшими потерями целевого белка, а также провести полную экстракцию целевого белка из растворенных телец включения. В процессе концентрирования и очистки рекомбинантного эфрина-А5 из солюбилизата телец включения c применением металл-хелатной хроматографии на Ni-сефарозе удалось получить целевой продукт чистотой 70,3 ± 7,4 % перед проведением рефолдинга. В результате скрининга основных характеристик рефолдинг-буфера для ренатурации рекомбинантного эфрина-А5 была выбрана следующая система: 20 ммоль/л трис-HCl; pH 8; 50 ммоль/л сахарозы; 2,5 ммоль/л DTT; 50 ммоль/л NaCl с конечной концентрацией эфрина-А5 в ренатурирующей системе до 20 мкг/мл и разведением в 10 раз. 

Биографии авторов

Александр Вячеславович Жидецкий, Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь

младший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории биохимии обмена веществ кафедры биохимии биологического факультета

Михаил Васильевич Шолух, Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь

кандидат биологических наук, доцент; заведующий научно-исследовательской лабораторией биохимии обмена веществ кафедры биохимии биологического факультета

Юрген Райнер Ханнеман, Биберахский университет прикладных наук, ул. Карлштрассе, 11, 888400, г. Биберах, Германия

доктор философии, профессор; декан факультета биотехнологии

Рене Хандрик, Биберахский университет прикладных наук, ул. Карлштрассе, 11, 888400, г. Биберах, Германия

доктор философии; заведующий лабораторией факультета фармацевтической биотехнологии

Жанна Витальевна Мотылевич, Гродненский государственный медицинский университет, ул. Горького, 80, 230009, г. Гродно, Беларусь

кандидат биологических наук; начальник отдела международных связей

Юха-Пекка Химанен, Институт исследования рака Sloan Kettering, 1275 Йорк авеню, 10065, г. Нью-Йорк, США

доктор философии; ведущий научный сотрудник

Литература

  1. Charmsaz S., Boyd A. W. Expression and function of the Eph receptor family in leukemia and hematopoietic malignancies: prospects for targeted therapies. J. Leuk. 2013. Vol. 1, issue 1. P. 1– 9. DOI: 10.4172/2329-6917.1000107.
  2. Himanen J.-P., Nikolov D. Eph receptors and ephrins. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2003. Vol. 35, No. 5. P. 130 –134. DOI: 10.1038/nrc2806.
  3. Pasquale E. B. Eph receptors and ephrins in cancer: bidirectional signaling and beyond. Nat. Rev. Cancer. 2010. Vol. 10, No. 3. P. 165 –180.
  4. Janes P. W., Adikari S., Lackmann M. Eph/ephrin signalling and function in oncogenesis: lessons from embryonic development. Curr. Cancer Drug Targets. 2008. Vol. 8, issue 6. P. 473– 479. DOI: 10.2174/156800908785699315.
  5. Zozulya S. A., Udovichenko I. P. Eph family receptors as therapeutic targets. Russ. J. Bioorg. Chem. 2012. Vol. 38, issue 3. P. 231–242. DOI: 10.1134/S106816201203017X.
  6. Guise A. D., West S. M., Chaudhuri J. B. Protein folding in vivo and renaturation of recombinant proteins from inclusion bodies. Mol. Biotechnol. 1996. Vol. 6, issue 1. P. 53–64. DOI: 10.1007/BF02762323.
  7. Peterson G. L. Determination of total protein. Methods Enzymol. 1983. No. 91. P. 95–119.
  8. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. No. 227. P. 680 – 685.
  9. Fairbanks G., Steck T. L., Wallach D. F. H. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 1971. Vol. 10, No. 13. P. 2606 –2617. DOI: 10.1021/bi00789a030.
  10. Damerval C., Le Guilloux M., Blaisonneau J., et al. A simplification of Heukeshoven and Dernick’s silver staining of proteins. Electrophoresis. 1987. Vol. 8, issue 3. P. 158–159. DOI: 10.1002/elps.1150080308.
  11. Georgiou G., Valax P. Isolating inclusion bodies from bacteria. Methods Enzymol. 1999. No. 309. P. 48 –58.
  12. Lilie H., Schwarz E., Rudolph R. Advances in refolding of proteins produced in E. coli. Curr. Opin. Biotechnol. 1998. Vol. 9, issue 5. P. 497–501.
  13. Misawa S., Kumagai I. Refolding of therapeutic proteins produced in Escherichia coli as inclusion bodies. Biopolymers-Peptide Sci. 1999. Vol. 51, issue 4. P. 297–307. DOI: 10.1002/(SICI)1097-0282(1999)51:4< 297::AID-BIP5>3.0.CO;2-I.
  14. Tsumoto K., Ejima D., Kumagai I., et al. Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies. Protein Exp. Purif. 2003. Vol. 28, issue 1. P. 1–8. 15. Vallejo L. F., Rinas U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb. Cell Fact. 2004. Vol. 3. P. 11–22. DOI: 10.1186/1475-2859-3-11.
  15. Middelberg A. P. Preparative protein refolding. Trends Biotechnol. 2002. Vol. 20, issue 10. P. 437– 443.
Опубликован
2017-12-16
Ключевые слова: эфрин-А5, скрининг условий рефолдинга, металл-хелатная хроматография, рекомбинантные белки, тельца включения
Поддерживающие организации Работа выполнена при финансовой поддержке БРФФИ в рамках программы «Наука-М» № Б16М-082, ГПНИ «Фундаментальные и прикладные науки – медицине» (задание 1.11) и международного проекта BMBF (IB-037) «Развитие новых методов для анализа образцов гликозилирования моноклональных антител».
Как цитировать
Жидецкий, А. В., Шолух, М. В., Ханнеман, Ю. Р., Хандрик, Р., Мотылевич, Ж. В., & Химанен, Ю.-П. (2017). Оптимизация условий очистки и рефолдинга рекомбинантного эфрина-А5 из телец включения Escherichia coli. Экспериментальная биология и биотехнология, 2, 58-65. Доступно по https://journals.bsu.by/index.php/biology/article/view/2446
Выпуск
№ 2 (2017): Журнал Белорусского государственного университета. Биология
Раздел
Биохимия

Авторы, публикующиеся в данном журнале, соглашаются со следующим:

  1. Авторы сохраняют за собой авторские права на работу и предоставляют журналу право первой публикации работы на условиях лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial. 4.0 International (CC BY-NC 4.0).
  2. Авторы сохраняют право заключать отдельные контрактные договоренности, касающиеся неэксклюзивного распространения версии работы в опубликованном здесь виде (например, размещение ее в институтском хранилище, публикацию в книге) со ссылкой на ее оригинальную публикацию в этом журнале.
  3. Авторы имеют право размещать их работу в интернете (например, в институтском хранилище или на персональном сайте) до и во время процесса рассмотрения ее данным журналом, так как это может привести к продуктивному обсуждению и большему количеству ссылок на данную работу. (См. The Effect of Open Access).