Анализ эффективности факторов электротрансформации клеток Bacillus subtilis для инактивации гена aroK путем гомологичной рекомбинации

  • Юй Чао Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь
  • Алексей Викторович Лагодич Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь https://orcid.org/0000-0002-6837-2439
DOI: https://doi.org/10.33581/2521-1722-2021-2-64-73

Аннотация

Оптимизирован метод гиперосмотической электротрансформации для штамма Bacillus subtilis. В состав гиперосмотической среды для электропорации и среды для восстановления были введены сорбит и маннит. Эффективность трансформации штамма B. subtilis 5434 (не трансформируемого химическими методами) возросла в 430 раз, ее максимальное значение составило 8,6 ⋅ 105 КОЕ/мкг интегративной плазмидной ДНК. При сохранении параметров 25 мкФ, 23 кВ/см, 200 Ом метод был оптимизирован следующим образом: а) бактериальную культуру при культивировании выращивали до достижения значений оптической плотности OD600 около 1,2, что существенно повысило выживаемость бактерий и количество жизнеспособных клеток B. subtilis 5434 после электропорации; б) число элюирований промывочным раствором (гиперосмотической средой для электропорации) электрокомпетентных клеток увеличено с 3 до 5 раз, что привело к значительному снижению электропроводимости гиперосмотической электропорационной среды, содержащей компетентные клетки (электрокомпетентной культуры), и эффективному увеличению времени истекания импульса при той же напряженности электрического поля; в) повышено количество интегративной плазмидной ДНК, вносимой в гиперосмотическую электрокомпетентную культуру. Полученные результаты свидетельствуют, что увеличение числа жизнеспособных клеток B. subtilis 5434 и уменьшение количества ионов металлов в смеси растворов для электропорации (интегративная плазмидная ДНК, компетентные клетки B. subtilis 5434, среда для электропорации) были успешным решением для повышения эффективности трансформации штамма B. subtilis 5434.

Биографии авторов

Юй Чао, Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь

аспирант кафедры генетики биологического факультета. Научный руководитель – А. В. Лагодич

Алексей Викторович Лагодич, Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь

кандидат биологических наук, доцент; доцент кафедры генетики биологического факультета

Литература

  1. Guoqiang Cao, Xiaohui Zhang, Lei Zhong, Zhaoxin Lu. A modifified electro-transformation method for Bacillus subtilis and its application in the production of antimicrobial lipopeptides. Biotechnology Letters. 2011;33(5):1047–1051. DOI: 10.1007/s10529- 011-0531-x.
  2. Kai Chen, Jie Dou, Shirui Tang, Yishun Yang, Hui Wang, Hongqing Fang, et al. Deletion of the aroK gene is essential for high shikimic acid accumulation through the shikimate pathway in E. coli. Bioresource Technology. 2012;119:141–147. DOI: 10.1016/j. biortech.2012.05.100.
  3. US Food and Drug Administration. Carbohydrase and protease enzyme preparations derived from Bacillus subtilis or Bacillus amyloliquefaciens. Affirmation of GRAS Status as direct food ingredients. Federal register. 1999;64(78):19887–19895.
  4. Duitman EH, Wyczawski D, Boven LG, Venema G, Kuipers OP, Hamoen LW. Novel methods for genetic transformation of natural Bacillus subtilis isolates used to study the regulation of the mycosubtilin and surfactin synthetases. Applied and Environmental Microbiology. 2007;73(11):3490–3496. DOI: 10.1128/AEM.02751-06.
  5. Spizizen J. Transfomtiom of biochemically deficient strains of Bacillus subtilis by deoxyribonucleate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1958;44(10):1072–1078. DOI: 10.1073/pnas.44.10.1072.
  6. Yasbin RE, Young FE. Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage. Journal of Virology. 1974;14(6):1343–1348.
  7. Vehmaanperä J. Electro-transformation of B. amyloliquefaciens and B. subtilis. In: Harwood CR, Cutting SM, editors. Molecular biological methods for Bacillus. New York: John Wiley; 1990. p. 156–157.
  8. Xue GP, Johnson JS, Dalrymple BP. High osmolarity improves the electro-transformation effificiency of the gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis. Journal of Microbiological Methods. 1999;34(3):183–191. DOI: 10.1016/S0167- 7012(98)00087-6.
  9. Dunny GM, Lee LN, LeBlanc DJ. Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 1991;57(4):1194–1201. DOI: 10.1128/AEM.57.4.1194-1201.1991.
  10. Martínez JA, Bolívar F, Escalante A. Shikimic acid production in Escherichia coli: from classical metabolic engineering stra tegies to omics applied to improve its production. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2015;3:145. DOI: 10.3389/fbioe. 2015.00145.
  11. Herrmann KM, Weaver LM. The shikimate pathway. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1999; 50:473–503. DOI: 10.1146/annurev.arplant.50.1.473.
  12. Jian Yi, Draths KM, Kai Li, Frost JW. Altered glucose transport and shikimate pathway product yields in E. coli. Biotechnology Progress. 2003;19(5):1450–1459. DOI: 10.1021/bp0340584.
  13. Ming-Yi Lee, Wen-Pin Hung, Shu-Hsien Tsai. Improvement of shikimic acid production in Escherichia coli with growth phase-dependent regulation in the biosynthetic pathway from glycerol. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2017;33(2):25. DOI: 10.1007/s11274-016-2192-3.
  14. Vagner V, Dervyn E, Ehrlich DS. A vector for systematic gene inactivation in Bacillus subtilis. Microbiology. 1998;144(11): 3097–3104. DOI: 10.1099/00221287-144-11-3097.
  15. Lagodich АV, Cherva ЕА, Shtanjuk YaV, Prokulevich VА, Fomichev YuK, Prozorov АА, et al. Construction of a vector system for molecular cloning in Bаcillus subtilis and Escherichia coli. Molecular Biology. 2005;39(2):345–348. Russian. DOI: 10.1007/ s11008-005-0043-7.
  16. Chao Yu, Shonina MY, Lahodzich AV. Design of the general concept of regulated inactivation of the gene shikimatkinase for modification of the shikimat way in bacteria Bacillus subtilis. Journal of the Belarusian State University. Biology. 2017;3:45–53. Russian.
  17. Guérout-Fleury AM, Shazand K, Frandsen N, Straiger P. Antibiotic-resistance cassettes for Bacillus subtilis. Gene. 1995;167(1–2): 335–336. DOI: 10.1016/0378-1119(95)00652-4.
  18. Yanglei Yi, Kuipers OP. Development of an effificient electroporation method for rhizobacterial Bacillus mycoides strains. Journal of Microbiological Methods. 2017;133:82–86. DOI: 10.1016/j.mimet.2016.12.022.
  19. Dorella FA, Estevam EM, Cardoso PG, Savassi BM, Oliveira SC, Azevedo V, et al. An improved protocol for electrotransformation of Corynebacterium pseudotuberculosis. Veterinary Microbiology. 2006;114(3–4):298–303. DOI: 10.1016/j.vetmic.2005.12.010.
  20. Miyagi T, Kaneichi K, Fukumura M, Karita S, Sakka K, Shimada K. Electro-transformation of Bacillus subtilis for expressing a ruminococcus albus cellulase gene. Nihon Chikusan Gakkaiho. 1993;65(5):407–415. DOI: 10.2508/chikusan.65.407.
  21. Kenneth FB, Gary AW. Development of competence in the Bacillus subtilis transformation system. Journal of Bacteriology. 1967;94(3):562–570.
  22. Fengli Chen, Kexin Hou, Shuangyang Li, Yuangang Zu, Lei Yang. Extraction and chromatographic determination of shikimic acid in Chinese conifer needles with 1-benzyl-3-methylimidazolium bromide ionic liquid aqueous solutions. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2014;2014:256473. DOI: 10.1155/2014/256473.
  23. Çiğdem A, Burçin EÖ, Mehmet LA. Quantification of shikimic acid in the methanolic extracts of three alnus taxons growing in Turkey. Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences. 2016;13(1):71–76.
  24. Dong-Feng Liu, Guo-Min Ai, Qing-Xiang Zheng, Chang Liu, Cheng-Ying Jiang, Li-Xia Liu, et al. Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by Bacillus subtilis strains. Microbial Cell Factories. 2014;13(1):40. DOI: 10.1186/1475-2859-13-40.
  25. van der Rest ME, Lange C, Molenaar D. A heat shock following electroporation induces highly effificient transformation of Corynebacterium glutamicum with xenogeneic plasmid DNA. Applied Microbiology and Biotechnology. 1999;52(4):541–545. DOI: 10.1007/s002530051557.
  26. Zhi Zhang, Zhong-Tao Ding, Dan Shu, Di Luo, Hong Tan. Development of an efficient electroporation method for Iturin A-producing Bacillus subtilis ZK. International Journal of Molecular Sciences. 2015;16(4):7334–7351. DOI: 10.3390/ijms16047334.
  27. Bonamy C, Guyonvarch A, Reyes O, David F, Leblon G. Interspecies electro-transformation in Corynebacteria. FEMS Microbiology Letters. 1990;66(1–3):263–269. DOI: 10.1111/j.1574-6968.1990.tb04008.x.
  28. Songer JG, Hilwig RW, Leeming MN, Iandolo JJ, Libby SJ. Transformation of Corynebacterium pseudotuberculosis by eletro poration. American Journal of Veterinary Research. 1991;52(8):1258–1261.
Опубликован
2021-07-05
Ключевые слова: Bacillus subtilis, гомологичная рекомбинация, гиперосмотическая электротрансформация, шикимат
Поддерживающие организации Авторы выражают благодарность кандидату биологических наук Е. О. Корик за помощь в проведении исследования методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Как цитировать
Юй Чао, & Лагодич, А. В. (2021). Анализ эффективности факторов электротрансформации клеток Bacillus subtilis для инактивации гена aroK путем гомологичной рекомбинации. Экспериментальная биология и биотехнология, 2, 64-73. https://doi.org/10.33581/2521-1722-2021-2-64-73
Выпуск
№ 2 (2021): Журнал Белорусского государственного университета. Биология
Раздел
Биотехнология и микробиология

Copyright (c) 2021 Журнал Белорусского государственного университета. Биология

Лицензия Creative Commons

Это произведение доступно по лицензии Creative Commons «Attribution-NonCommercial» («Атрибуция — Некоммерческое использование») 4.0 Всемирная.

Авторы, публикующиеся в данном журнале, соглашаются со следующим:

  1. Авторы сохраняют за собой авторские права на работу и предоставляют журналу право первой публикации работы на условиях лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial. 4.0 International (CC BY-NC 4.0).
  2. Авторы сохраняют право заключать отдельные контрактные договоренности, касающиеся неэксклюзивного распространения версии работы в опубликованном здесь виде (например, размещение ее в институтском хранилище, публикацию в книге) со ссылкой на ее оригинальную публикацию в этом журнале.
  3. Авторы имеют право размещать их работу в интернете (например, в институтском хранилище или на персональном сайте) до и во время процесса рассмотрения ее данным журналом, так как это может привести к продуктивному обсуждению и большему количеству ссылок на данную работу. (См. The Effect of Open Access).