Нокаут генов Т-клеточного рецептора и HLA класса I в клетках человека с использованием системы CRISPR /Cas9

  • Елизавета Викторовна Кушнерова Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, ул. Фрунзенская, 43, 223053, д. Боровляны, Минский район, Беларусь
  • Александр Александрович Мигас Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, ул. Фрунзенская, 43, 223053, д. Боровляны, Минский район, Беларусь
  • Анна Васильевна Клыч Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, ул. Фрунзенская, 43, 223053, д. Боровляны, Минский район, Беларусь
  • Евгений Анатольевич Ласюков Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, ул. Фрунзенская, 43, 223053, д. Боровляны, Минский район, Беларусь
  • Александр Николаевич Мелешко Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, ул. Фрунзенская, 43, 223053, д. Боровляны, Минский район, Беларусь

Аннотация

Система геномного редактирования CRISPR /Cas9, как инструмент для нокаута генов, нашла широкое применение в клеточной биологии для получения клеток определенного фенотипа. В частности, она используется для создания универсальных донорских CAR-T-лимфоцитов путем нокаута генов TRAC, TRBC1 и TRBC2 T-клеточногорецептора и гена B2M, входящего в состав HLA класса I. Для получения большого количества клеток нужного фенотипа необходимо оптимизировать систему геномного редактирования, эффективность которой определяется используемой sgRNA. В настоящей работе экспериментально определены последовательности, позволяющие получить до 60,3 % клеток, негативных по экспрессии белка B2M, и до 71,8 % клеток, негативных по экспрессии Т-клеточного рецептора. Также показано, что одновременное использование двух sgRNA для нокаута гена демонстрирует более низкую эффективность по сравнению с использованием данных sgRNA по отдельности.

Биографии авторов

Елизавета Викторовна Кушнерова, Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, ул. Фрунзенская, 43, 223053, д. Боровляны, Минский район, Беларусь

младший научный сотрудник лаборатории генетических биотехнологий

Александр Александрович Мигас, Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, ул. Фрунзенская, 43, 223053, д. Боровляны, Минский район, Беларусь

старший научный сотрудник лаборатории иммунологии

Анна Васильевна Клыч, Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, ул. Фрунзенская, 43, 223053, д. Боровляны, Минский район, Беларусь

младший научный сотрудник лаборатории генетических биотехнологий

Евгений Анатольевич Ласюков, Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, ул. Фрунзенская, 43, 223053, д. Боровляны, Минский район, Беларусь

младший научный сотрудник лаборатории иммунологии

Александр Николаевич Мелешко, Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, ул. Фрунзенская, 43, 223053, д. Боровляны, Минский район, Беларусь

кандидат биологических наук; заведующий лабораторией генетических биотехнологий

Литература

  1. Peng R, Lin G, Li J. Potential pitfalls of CRISPR /Cas9-mediated genome editing. FEBS Journal. 2016;283(7):1218–1231. DOI: 10.1111/febs.13586.
  2. Depil S, Duchateau P, Grupp SA, Mufti G, Poirot L. «Off-the-shelf» allogeneic CAR T cells: development and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 2020;19(3):185–199. DOI: 10.1038/s41573-019–0051-2.
  3. Daer RM, Cutts JP, Brafman DA, Haynes KA. The impact of chromatin dynamics on Cas9-mediated genome editing in human cells. ACS Synthetic Biology. 2017;6(3):428–438. DOI: 10.1021/acssynbio.5b00299.
  4. Concordet J-P, Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR /Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 2018;46(W1):W242–W245. DOI: 10.1093/nar/gky354.
  5. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 2013;8(11):2281–2308. DOI: 10.1038/nprot.2013.143.
  6. Alharbi AB, Schmitz U, Bailey CG, Rasko JEJ. CTCF as a regulator of alternative splicing: new tricks for an old player. Nucleic Acids Research. 2021;49(14):7825–7838. DOI: 10.1093/nar/gkab520.
  7. Mandal PK, Ferreira LMR, Collins R, Meissner TB, Boutwell CL, Friesen M, et al. Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR /Cas9. Cell Stem Cell. 2014;15(5):643–652. DOI: 10.1016/j.stem.2014.10.004.
  8. Yuen G, Khan FJ, Gao S, Stommel JM, Batchelor E, Wu X, et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout is insensitive to target copy number but is dependent on guide RNA potency and Cas9/sgRNA threshold expression level. Nucleic Acids Research. 2017;45(20):12039–12053. DOI: 10.1093/nar/gkx843.
  9. Ren J, Zhang X, Liu X, Fang C, Jiang S, June CH, et al. A versatile system for rapid multiplex genome-edited CAR T cell generation. Oncotarget. 2017;8(10):17002–17011. DOI: 10.18632/oncotarget.15218.
  10. Joberty G, Fälth-Savitski M, Paulmann M, Bösche M, Doce C, Cheng AT, et al. A tandem guide RNA-based strategy for efficient CRISPR gene editing of cell populations with low heterogeneity of edited alleles. CRISPR Journal. 2020;3(2):123–134. DOI: 10.1089/crispr.2019.0064.
Опубликован
2022-07-06
Ключевые слова: CRISPR/Cas9, sgRNA, Т-клеточный рецептор, B2M, нокаут гена
Как цитировать
Кушнерова, Е. В., Мигас, А. А., Клыч, А. В., Ласюков, Е. А., & Мелешко, А. Н. (2022). Нокаут генов Т-клеточного рецептора и HLA класса I в клетках человека с использованием системы CRISPR /Cas9. Экспериментальная биология и биотехнология, 2, 19-26. https://doi.org/10.33581/2957-5060-2022-2-19-26
Раздел
Генетика и молекулярная биология