Оценка концентрации и яркости молекул на основе управляемого изменения интенсивности флуоресценции

Авторы

  • Виктор Васильевич Скакун Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь
  • Владимир Владимирович Апанасович Независимый исследователь, г. Минск, Беларусь

Ключевые слова:

флуоресцентная флуктуационная спектроскопия, производящий функционал, распределение числа фотоотсчетов, РЧФ, вероятность отсутствия фотоотсчетов на интервале регистрации, анализ распределения интенсивности флуоресценции, анализ гистограмм счета фотонов
Поддерживающие организации
Авторы выражают признательность отделу паразитологии Медицинского центра Лейденского университета (Нидерланды), и в частности доктору О. Майбороде, за предоставленные результаты измерения распределения числа фотоотсчетов раствора красителя Alexa-488 в буфере.

Аннотация

Предложен новый метод оценки концентрации и характеристической яркости сложных молекулярных комплексов во флуоресцентной флуктуационной спектроскопии на основе измерения вероятности отсутствия фотоотсчетов на интервале регистрации для различных значений интенсивности возбуждения. Изменение интенсивности возбуждения можно реализовать посредством изменения мощности лазера, смены нейтральных фильтров, которые ослабляют интенсивность излучения лазера, и независимого прореживания фотоотсчетов. Основой метода является выражение, связывающее вероятность отсутствия фотоотсчетов на интервале регистрации с коэффициентом аттенюации интенсивности возбуждения. Выведены выражения с учетом и без учета коррекции на внефокусное излучение. Оценки параметров исследуемого вещества находятся путем анализа полученной нелинейной зависимости с помощью метода наименьших квадратов. Разработанный метод прост в реализации, он не требует измерения сложных характеристик регистрируемого потока фотоотсчетов и, как следствие, допускает использование детектора со значительным мертвым временем и вероятностью генерации послеимпульсов. Работоспособность метода проверена на основе анализа смоделированных и экспериментально измеренных данных и сравнения его результатов с результатами, полученными с помощью метода анализа гистограмм счета фотонов.

Биографии авторов

  • Виктор Васильевич Скакун, Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь

    кандидат физико-математических наук, доцент; заведующий кафедрой системного анализа и компьютерного моделирования факультета радиофизики и компьютерных технологий

  • Владимир Владимирович Апанасович, Независимый исследователь, г. Минск, Беларусь

    доктор физико-математических наук, профессор; независимый исследователь

Библиографические ссылки

  1. Kitamura A, Kinjo M. State-of-the-art fluorescence fluctuation-based spectroscopic techniques for the study of protein aggregation. International Journal of Molecular Sciences. 2018;19(4):964. DOI: 10.3390/IJMS19040964.
  2. Yu L, Lei Y, Ma Y, Liu M, Zheng J, Dan D, et al. A comprehensive review of fluorescence correlation spectroscopy. Frontiers in Physics. 2021;9:644450. DOI: 10.3389/FPHY.2021.644450.
  3. Hink MA, Borst JW, Visser AJWG. Fluorescence correlation spectroscopy of GFP fusion proteins in living plant cells. In: Marriott G, Parker I, editors. Biophotonics. Part B. San Diego: Academic Press; 2003. p. 93–112 (Methods in enzymology; volume 361). DOI: 10.1016/S0076-6879(03)61007-4.
  4. Elson EL. Fluorescence correlation spectroscopy: past, present, future. Biophysical Journal. 2011;101(12):2855–2870. DOI: 10.1016/j.bpj.2011.11.012.
  5. Kask P, Palo K, Ullmann D, Gall K. Fluorescence-intensity distribution analysis and its application in biomolecular detection technology. PNAS. 1999;96(24):13756 –13761. DOI: 10.1073/pnas.96.24.13756.
  6. Chen Y, Müller JD, So PTC, Gratton E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 1999;77(1):553–567. DOI: 10.1016/S0006-3495(99)76912-2.
  7. Huang B, Perroud TD, Zare RN. Photon counting histogram: one-photon excitation. ChemPhysChem. 2004;5(10):1523–1531. DOI: 10.1002/cphc.200400176.
  8. Müller JD. Cumulant analysis in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 2004;86(6):3981–3992. DOI: 10.1529/biophysj.103.037887.
  9. Скакун ВВ, Апанасович ВВ. Анализ смеси «мономер – олигомер» в системах одноквантовой флуоресцентной флуктуационной спектроскопии. Вестник БГУ. Серия 1, Физика. Математика. Информатика. 2016;2:52–59. EDN: WANNRJ.
  10. Nederveen-Schippers LM, Pathak P, Keizer-Gunnink I, Westphal AH, van Haastert PJM, Borst JW, et al. Combined FCS and PCH analysis to quantify protein dimerization in living cells. International Journal of Molecular Sciences. 2021;22(14):7300. DOI: 10.3390/IJMS22147300.
  11. Palo K, Mets Ü, Jäger S, Kask P, Gall K. Fluorescence intensity multiple distributions analysis: concurrent determination of diffusion times and molecular brightness. Biophysical Journal. 2000;79(6):2858 –2866. DOI: 10.1016/S0006-3495(00)76523-4.
  12. Perroud TD, Huang B, Zare RN. Effect of bin time on the photon counting histogram for one-photon excitation. ChemPhysChem. 2005;6(5):905– 912. DOI: 10.1002/cphc.200400547.
  13. Wu B, Singer RH, Mueller JD. Time-integrated fluorescence cumulant analysis and its application in living cells. In: Tetin SY, editor. Fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS). Part A. San Diego: Academic Press; 2013. p. 99 –119 (Methods in enzymology; volume 518). DOI: 10.1016/B978-0-12-388422-0.00005-4.
  14. Skakun VV, Engel R, Digris AV, Borst JW, Visser AJWG. Global analysis of autocorrelation functions and photon counting distributions. Frontiers in Bioscience – Elite. 2011;3(2):489 –505. DOI: 10.2741/e264.
  15. Skakun VV, Digris AV, Apanasovich VV. Global analysis of autocorrelation functions and photon counting distributions in fluorescence fluctuation spectroscopy. In: Engelborghs Y, Visser AJWG, editors. Fluorescence spectroscopy and microscopy: methods and protocols. Totowa: Humana Press; 2014. p. 719 –741 (Methods in molecular biology; volume 1076). DOI: 10.1007/978-1-62703-649-8_33.
  16. Scales N, Swain PS. Resolving fluorescent species by their brightness and diffusion using correlated photon-counting histograms. PLoS One. 2019;14(12):e0226063. DOI: 10.1371/journal.pone.0226063.
  17. Gopich IV, Kim J-Y, Chung HS. Analysis of photon trajectories from diffusing single molecules. The Journal of Chemical Physics. 2023;159(2):024119. DOI: 10.1063/5.0153114.
  18. Скакун ВВ, Апанасович ВВ. Использование аппарата производящих функционалов для анализа потоков фотоотсчетов в системах одноквантовой регистрации интенсивности флуоресценции. Журнал прикладной спектроскопии. 2025;92(2):235 –245. EDN: WLQAUC.
  19. Апанасович ВВ, Коляда АА, Чернявский АФ. Статистический анализ случайных потоков в физическом эксперименте. Минск: Университетское; 1988. 254 c.
  20. Большаков ИА, Ракошиц ВС. Прикладная теория случайных потоков. Москва: Советское радио; 1978. 248 с.
  21. Скакун ВВ, Апанасович ВВ. Расчет распределения числа фотоотсчетов в системах регистрации флуктуаций интенсивности флуоресценции. Журнал Белорусского государственного университета. Физика. 2023;2:22–38. EDN: GSQXFP.
  22. Hess ST, Webb WW. Focal volume optics and experimental artifacts in confocal fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. 2002;83(4):2300 –2317. DOI: 10.1016/S0006-3495(02)73990-8.
  23. Shingaryov IP, Skakun VV, Apanasovich VV. Simulation of a stream of photon counts in single-molecule fluorescence fluctuation spectroscopy. Journal of Applied Spectroscopy. 2012;78(6):892– 898. DOI: 10.1007/s10812-012-9549-7.
  24. Shingaryov IP, Skakun VV, Apanasovich VV. Simulation of autocorrelation function and photon counting distribution in fluorescence fluctuation spectroscopy. In: Engelborghs Y, Visser AJWG, editors. Fluorescence spectroscopy and microscopy: methods and protocols. Totowa: Humana Press; 2014. p. 743–755 (Methods in molecular biology; volume 1076). DOI: 10.1007/978-1-62703-649-8_34.
  25. Bevington PR, Robinson DK. Data reduction and error analysis for the physical sciences. 3rd edition. Boston: McGraw-Hill; 2003. XII, 320 p.
  26. Schwille P, Haupts U, Maiti S, Webb WW. Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two-photon excitation. Biophysical Journal. 1999;77(4):2251–2265. DOI: 10.1016/S0006-3495(99)77065-7.
  27. Skakun VV, Novikov EG, Apanasovich TV, Apanasovich VV. Fluorescence cumulants analysis with non-ideal observation profiles. Methods and Applications in Fluorescence. 2015;3(4):045003. DOI: 10.1088/2050-6120/3/4/045003.

Загрузки

Дополнительные файлы

Опубликован

2026-04-10

Выпуск

№ 1 (2026): Журнал Белорусского государственного университета. Физика

Раздел

Оптика и спектроскопия

Лицензия

Copyright (c) 2026 Журнал Белорусского государственного университета. Физика

Лицензия Creative Commons

Это произведение доступно по лицензии Creative Commons «Attribution-NonCommercial» («Атрибуция — Некоммерческое использование») 4.0 Всемирная.

Авторы, публикующиеся в данном журнале, соглашаются со следующим:

  1. Авторы сохраняют за собой авторские права на работу и предоставляют журналу право первой публикации работы на условиях лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial. 4.0 International (CC BY-NC 4.0).
  2. Авторы сохраняют право заключать отдельные контрактные договоренности, касающиеся неэксклюзивного распространения версии работы в опубликованном здесь виде (например, размещение ее в институтском хранилище, публикацию в книге) со ссылкой на ее оригинальную публикацию в этом журнале.
  3. Авторы имеют право размещать их работу в интернете (например, в институтском хранилище или на персональном сайте) до и во время процесса рассмотрения ее данным журналом, так как это может привести к продуктивному обсуждению и большему количеству ссылок на данную работу. (См. The Effect of Open Access).

Как цитировать

(1)
Скакун, В.; Апанасович, В. Оценка концентрации и яркости молекул на основе управляемого изменения интенсивности флуоресценции. Журнал Белорусского государственного университета. Физика 2026, вып. 1, 13-25. https://doi.org/10.33581/2520-2243-2026-1-%p.
Crossref
Scopus
Google Scholar
Europe PMC