Оценка эффективности инактивации шикиматкиназы у рекомбинантных штаммов – продуцентов шикимовой кислоты Вacillus subtilis 168wt21СSA и В. subtilis 5434p4SA

  • Чао Юй Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь
  • Елена Олеговна Корик Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь
  • Алексей Викторович Лагодич Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь

Аннотация

Прототрофные штаммы Вacillus subtilis 168wt и В. subtilis ВКПМ 5434 трансформированы рекомбинантными конструкциями, содержащими фрагмент гена шикиматкиназы. За счет гомологичной рекомбинации осуществлена интеграция векторных конструкций в состав бактериальной хромосомы трансформируемых штаммов с образованием рекомбинантных штаммов В. subtilis 168wt21СSA и В. subtilis 5434p4SA. Конструктивные отличия между полученными штаммами обусловлены механизмом инактивации гена шикиматкиназы: при использовании конструкции pMTL21CΔaroK (штамм В. subtilis 168wt21СSA) реализована необратимая инактивация, а при использовании конструкции pMUTIN4ΔaroK (штамм В. subtilis 5434p4SA) – регулируемая (индуцируемая ИПТГ) экспрессия гена шикиматкиназы. Изучены морфофизиологические и биохимические особенности штаммов В. subtilis 168wt21СSA и В. subtilis 5434p4SA. У обоих штаммов в нативных условиях отмечены утрата прототрофных свойств и приобретение способности к повышенному синтезу шикимовой кислоты. Для штамма B. subtilis 5434p4SA продемонстрирован эффект восстановления прототрофных свойств у части клеток бактериальной популяции при активации экспрессии гена шикиматкиназы в присутствии ИПТГ. Выявлена зависимость изменения числа клеток с активированным геном шикиматкиназы от концентрации индуктора в среде. С применением метода ВЭЖХ показано, что у полученных штаммов-кандидатов шикимовая кислота синтезируется эффективнее, чем у соответствующих штаммов-предшественников: ее содержание в культуральной среде может достигать 564 мкг/мл для штамма В. subtilis 168wt21СSA и 732 мкг/мл для штамма В. subtilis 5434p4SA, т. е. более чем в 2,5 раза превышать таковые значения для исходных штаммов.

Биографии авторов

Чао Юй, Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь

аспирантка кафедры генетики биологического факультета. Научный руководитель – А. В. Лагодич

Елена Олеговна Корик, Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь

кандидат биологических наук, доцент; доцент кафедры биохимии биологического факультета

Алексей Викторович Лагодич, Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, 220030, г. Минск, Беларусь

кандидат биологических наук, доцент; доцент кафедры генетики биологического факультета

Литература

  1. Bentley R, Haslam E. The shikimate pathway – a metabolic tree with many branche. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 1990;25(5):307–384. DOI: 10.3109/10409239009090615.
  2. Herrmann KM, Weaver LM. The shikimate pathway. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1999;0:473–503. DOI: 10.1146/annurev.arplant.50.1.473.
  3. Humphrey CE, Furegati M, Laumen K, La Vecchia L, Leutert T, Müller-Hartwieg JCD, et al. Optimized synthesis of L-m-tyrosine suitable for chemical scale-up. Organic Process Research & Development. 2007;11(6):1069–1075. DOI: 10.1021/op700093y.
  4. Gilyarov MS, Baev AA, Vinberg GG, Zavarzin GA, Ivanov AV, Severin SE, et al., editors. Biologicheskii entsiklopedicheskii slovar’ [Biological encyclopedic dictionary]. Moscow: Sovetskaya entsiklopediya; 1986. 831 p. Russian.
  5. Meyskens FL Jr, Farmer P, Fruehauf JP. Redox regulation in human melanocytes and melanoma. Pigment Cell Research. 2001;14(3):148–154. DOI: 10.1034/j.1600-0749.2001.140303.x.
  6. Fang Ming-Yue, Zhang Chong, Yang Song, Cui Jin-Yu, Jiang Pei-Xia, Lou Kai, et al. High crude violacein production from glucose by Escherichia coli engineered with interactive control of tryptophan pathway and violacein biosynthetic pathway. Microbial Cell Factories. 2015;14:8. DOI: 10.1186/s12934-015-0192-x.
  7. Ul-Haq I, Ali S. Microbiological transformation of L-tyrosine to 3,4-dihydroxyphenyl L-alanine (L-dopa) by a mutant strain of Aspergillus oryzae UV-7. Current Microbiology. 2002;45(2):88–93. DOI: 10.1007/s00284-001-0080-y.
  8. Davis BD. Aromatic biosynthesis. I. The role of shikimic acid. Journal of Biological Chemistry. 1951;191(1):315–325. DOI: 10.1016/S0021-9258(18)50982-0.
  9. Dell KA, Frost JW. Identification and removal of impediments to biocatalytic synthesis of aromatics from D-glucose: rate-limiting enzymes in the common pathway of aromatic amino acid biosynthesis. Journal of the American Chemical Society. 1993;115(24):11581–11589. DOI: 10.1021/ja00077a065.
  10. Chandran SS, Yi J, Draths KM, von Daeniken R, Weber W, Frost JW. Phosphoenolpyruvate availability and the biosynthesis of shikimic acid. Biotechnology Progress. 2003;19(3):808–814. DOI: 10.1021/bp025769p.
  11. Weber C, Brückner C, Weinreb S, Lehr C, Essl C, Boles E. Biosynthesis of cis,cis-muconic acid and its aromatic precursors, catechol and protocatechuic acid, from renewable feedstocks by Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology. 2012;78(23):8421–8430. DOI: 10.1128/AEM.01983-12.
  12. Curran KA, Leavitt JM, Karim AS, Alper HS. Metabolic engineering of muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 2013;15:55–66. DOI: 10.1016/j.ymben.2012.10.003.
  13. Wang S, Bilal M, Zong Y, Hu H, Wang W, Zhang X. Development of a plasmid-free biosynthetic pathway for enhanced muconic acid production in Pseudomonas chlororaphis HT66. ACS Synthetic Biology. 2018;7(4):1131–1142. DOI: 10.1021/acssynbio.8b00047.
  14. Liu Dong-Feng, Ai Guo-Min, Zheng Qing-Xiang, Liu Chang, Jiang Cheng-Ying, Liu Li-Xia, et al. Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by Bacillus subtilis strains. Microbial Cell Factories. 2014;13:40. DOI: 10.1186/1475-2859-13-40.
  15. Chao Y, Shonina MY, Lahodzich AV. Design of the general concept of regulated inactivation of the gene shikimatkinase for modification of the shikimat way in bacteria Bacillus subtilis. Journal of the Belarusian State University. Biology. 2017;3:45–53. Russian.
  16. Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 complete genome [Internet]. Bethesda: National Library of Medicine, National Center for Biomedical Information; 2023 [cited 2022 July 14]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000964.3.
  17. UniProt [Internet]. [S. l.]: UniProt consortium; 2002–2023 [cited 2022 July 14]. Available from: https://www.uniprot.org/.
  18. Chambers SP, Prior SE, Barstow DA, Minton NP. The pMTL nic– cloning vectors. I. Improved pUC polylinker regions to facilitate the use of sonicated DNA for nucleotide sequencing. Gene. 1988;68(1):139–149. DOI: 10.1016/0378-1119(88)90606-3.
  19. Chao Y, Lahodzich AV. Analysis of the efficiency factors of electrotransformation of Bacillus subtilis to inactivate the aroK gene by the method of homologous recombination. Journal of the Belarusian State University. Biology. 2021;2:64–73. DOI: 10.33581/2521-1722-2021-2-64-73.
  20. Vagner V, Dervyn E, Ehrlich SD. A vector for systematic gene inactivation in Bacillus subtilis. Microbiology. 1998;144(11):3097–3104. DOI: 10.1099/00221287-144-11-3097.
  21. Jiang JJ, Liu T, Lin SJ. [Research progress on the biosynthesis of aromatic compounds by microorganisms]. Chinese Bulletin of Life Sciences. 2019;31(5):430–448. Chinese.
  22. Spizizen J. Transformation of biochemically deficient strains of Bacillus subtilis by deoxyribonucleate. PNAS. 1958;44(10):1072–1078. DOI: 10.1073/pnas.44.10.1072.
  23. Guérout-Fleury A-M, Shazand K, Frandsen N, Stragier P. Antibiotic-resistance cassettes for Bacillus subtilis. Gene. 1995;167(1–2):335–336. DOI: 10.1016/0378-1119(95)00652-4.
  24. Lysak VV, Zheldakova RA, Fomina OV. Mikrobiologiya [Microbiology]. Minsk: Belarusian State University; 2015. 115 p. Russian.
  25. Bott KF, Wilson GA. Development of competence in the Bacillus subtilis transformation system. Journal of Bacteriology. 1967;94(3):562–570. DOI: 10.1128/jb.94.3.562-570.1967.
  26. Chen Fengli, Hou Kexin, Li Shuangyang, Zu Yuangang, Yang Lei. Extraction and chromatographic determination of shikimic acid in Chinese conifer needles with 1-benzyl-3-methylimidazolium bromide ionic liquid aqueous solutions. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2014:256473. DOI: 10.1155/2014/256473.
  27. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 1983;166(4):557–580. DOI: 10.1016/s0022-2836(83)80284-8.
  28. Altinyay Ç, Ergene Öz B, Altun ML. Quantification of shikimic acid in the methanolic extracts of three Alnus taxons growing in Turkey. Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences. 2016;13(1):115–120.
Опубликован
2023-06-26
Ключевые слова: Bacillus subtilis, гомологичная рекомбинация, инактивация шикиматкиназы, метаболический путь шикимата, тест на синтрофизм, индуктор ИПТГ, промотор Pspac
Как цитировать
Юй, Ч., Корик, Е. О., & Лагодич, А. В. (2023). Оценка эффективности инактивации шикиматкиназы у рекомбинантных штаммов – продуцентов шикимовой кислоты Вacillus subtilis 168wt21СSA и В. subtilis 5434p4SA. Экспериментальная биология и биотехнология, 2, 52-64. Доступно по https://journals.bsu.by/index.php/biology/article/view/5533
Раздел
Биотехнология и микробиология